Seventh Commission Directive

of 1 March 1976

establishing Community methods of analysis for the official control of feedingstuffs

(76/372/EEC) (repealed)

F1. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Annotations:

F1Article 1

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F1Article 2

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F1Article 3

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F1ANNEXDETERMINATION OF AFLATOXIN B1

F1A.ONE-DIMENSIONAL THIN LAYER CHROMATOGRAPHIC METHOD

F11.Purpose and scope

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F12.Principle

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F13.Reagents

F13.1.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F13.2.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F13.3.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F13.4.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F13.5.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F13.6.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F13.7.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F13.8.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F13.9.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F13.10.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F13.11.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F13.12.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F13.13.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F13.14.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F13.15.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F13.16.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F13.17.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F13.18.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F13.18.1.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F13.18.2.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F13.18.3.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F13.18.4.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F13.18.5.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F14.Apparatus

F14.1.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F14.2.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F14.3.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F14.4.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F14.5.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F14.6.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F14.7.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F14.8.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F14.9.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F14.10.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F14.11.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F14.12.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F15.Procedure

F15.1.Preparation of the sample (see under‘Observations’, Part C, point 1).

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F15.2.Extraction

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F15.3.Column clean-up

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F15.4.Thin-layer chromatography

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F15.5.Quantitative determinations

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F15.5.1.Visual measurements

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F15.5.2.Measurements by fluorodensitometry

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F15.6.Confirmation of the identity of aflatoxin B1

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F15.6.1.Treatment with sulphuric acid

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F15.6.2.Two-dimensional chromatography involving the formation of aflatoxin B1-hemiacetal (aflatoxin B2a)

F15.6.2.1.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F15.6.2.2.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F15.6.2.3.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F16.Calculation of the results

F16.1.From the visual measurements

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F16.2.From the fluorodensitometric measurements

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F17.Preparation and testing of the standard solution (3.16)

F17.1.Determination of the concentration of aflatoxinB1

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F17.2.Testing of chromatographic purity

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F18.Repeatability

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F19.Reproducibility

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F1B.DETERMINATION OF AFLATOXIN B1. HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHIC METHOD

F11.Purpose and scope

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F12.Principle

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F13.Reagents

F13.1.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F13.2.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F13.3.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F13.4.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F13.5.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F13.5.1.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F13.5.2.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F13.5.3.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F13.6.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F13.7.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F13.8.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F13.9.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F13.10.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F13.11.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F13.12.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F13.12.1.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F13.13.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F13.13.1.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F13.13.2.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F13.13.3.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F13.13.4.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F13.14.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F13.14.1.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F13.15.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F13.15.1.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F13.15.2.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F14.Apparatus

F14.1.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F14.2.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F14.3.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F14.4.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F14.5.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F14.6.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F14.7.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F14.8.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F14.9.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F14.10.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F14.11.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F14.12.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F14.13.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F14.14.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F14.15.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F14.16.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F14.17.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F14.18.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F14.19.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F14.20.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F14.21.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F14.22.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F14.23.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F14.24.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F14.24.1.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F14.24.2.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F15.Procedure

F15.1.Preparation of the sample.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F15.2.Test portion.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F15.3.Extraction

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F15.4.Clean-up (the procedure should be carried out without significant interruptions).

F15.4.1.Florisil SEP-PAK purification

F15.4.1.1.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F15.4.1.2.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F15.4.2.C18 SEP-PAK purification

F15.4.2.1.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F15.4.2.2.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F15.5.High performance liquid chromatography

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F15.5.1.HPLC pump settings

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F15.5.2.Post-column pump settings

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F15.5.3.Fluorescence detector

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F15.5.4.Injector

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F15.5.5.Check of chromatographic separation

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F15.5.6.Check of the stability of the system

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F15.5.7.Check of linearity

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F15.5.8.Injection of sample extracts

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F16.Confirmatory test

F16.1.Further treatment of the extract (5.4.2.2)

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F16.2.Preparation of derivative and thin layer chromatography:

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F17.Calculation of results

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F17.1.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F18.Repeatability:

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F19.Reproducibility:

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F110.Observations

F110.1.Precision

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F110.2.Stabilization of chloroform (3.1)

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F110.3.Accuracy

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F1C.OBSERVATIONS CONCERNING METHODS A AND B

F11.Defatting

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F12.Reproducibility of the results for Method A

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F1Appendix to Annex

F1. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F1. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

F1. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .